CITOGENÉTICA

Sección Genética Evolutiva. Facultad de Ciencias. Montevideo, Uruguay

Drs. Francisco Panzera & Ruben Pérez

1.- MATERIAL DE ESTUDIOS CROMOSOMICOS

Material: Gónadas de machos y hembras, de individuos adultos. Solo excepcionalmente pueden ser utilizados ninfas de quinto estadio.

Extracción del material: Debe ser realizada solamente sobre individuos vivos. No sirven ejemplares muertos.

Fijación del material: Las gónadas, una vez extraídas, deben ser sumergidas inmediatamente en un líquido fijador, denominado 3: 1, el cual debe ser preparado en el momento. Este líquido fijador está compuesto por etanol absoluto (3 partes) y ácido acético glacial (una parte). A la hora de fijación y a las 24 horas se debe cambiar el fijador por otro preparado en el momento. Este material, debidamente identificado con el número del individuo, se guarda en un refrigerador a -20º C, o en su defecto en heladera 4º C.

2.- ENVIO DEL MATERIAL POR CORREO

Se realiza en los frascos de fijación, debidamente sellados herméticamente a temperatura ambiente.

3.- TÉCNICAS CITOGENÉTICAS

A.- Tinción con orceína acético-láctica mediante el método de aplastado

En primer lugar se limpian los portaobjetos en una mezcla de 30 ml de agua destilada +10 ml del etanol + 10 ml de ácido acético. Se dejan así unos minutos y después se limpian con toallas sanitarias o pañuelos de papel que no dejen residuos ni fibras.

Para preparar la orceína acético-láctica se disuelven 2 gramos de orceína sintética (Sigma 07380) en 100 ml de una solución compuesta por 45 ml de ácido láctico y 55 ml de ácido acético glacial ppa. Se calienta hasta la primera ebullición y se deja reposar durante 24 horas. Luego se filtra quedando lista para usarse. Esta orceína se debe almacenar a temperatura ambiente, en un frasco ámbar o protegido de la luz con aluminio.

Para realizar la tinción se saca el material previamente fijado en 3:1 y almacenado a -20º C. La primera etapa es la de limpieza de tráqueas que perjudican la obtención de un buen aplastado. Para lo cual se coloca en un vidrio de reloj, parte de la gónada en 3:1. Se procede a la extracción de las tráqueas y de aquellas estructuras que no correspondan a las gónadas, tales como parte del tubo digestivo o glándulas anexas. Una vez realizada la limpieza, los trozos seleccionados de las gónadas se colocan en un vidrio de reloj con ácido acético al 50% (preparado en el momento) por no mas de 2 a 3 minutos. El material se ablanda (macera) de esta manera y se disgrega con dos pinzas sobre un portaobjetos previamente identificado con el número del individuo analizado. De manera de facilitar esto último, dicha disgregación se realiza sobre una superficie obscura (puede ser una revista con cubierta negra o cartón negro) y se le ponen encima 2 o 3 gotas de orceína. Se debe tener la precaución de que en ningún momento el material quede seco. Luego se le coloca encima un cubreobjetos dejándolo caer desde una posición de 45º, cuidando de que el material quede en el centro del cubreobjeto. En el caso de que quedaran burbujas de aire se deben sacar mediante suaves golpes con un lápiz de grafo. La preparación se deja con el colorante de 2 a 3 horas.

Posteriormente se procede a la dispersión (extendido) del material con un lápiz de grafo, golpeando el cubreobjeto de forma vertical y concéntrica, desde el centro hacia afuera. Se debe evitar todo desplazamiento lateral del cubreobjeto pues ello provocará que las células se rompan.

Luego se procede al aplastado propiamente dicho, para lo cual se coloca una toalla de papel sobre el cubreobjetos, inmovilizando desde una esquina y con el dedo pulgar se realiza una fuerte presión sobre varios lugares del portaobjetos. Es muy importante que dicha presión se realice de forma vertical, evitando que se mueva lateralmente el cubreobjetos. Para aplastar se recarga el dedo pulgar de forma vertical con todo el cuerpo por 3 o 4 veces. Se inmoviliza sobre otra esquina y se vuelve a hacer el aplastado. Se limpia el exceso de colorante, cuidando de no mover el cubreobjeto, y se comprueba bajo el microscopio que:

a) El nivel de coloración. En caso de que fuera pálida puede colocarse el portaobjeto sobre una fuente de luz por varias horas para facilitar la tinción de las células.

b) En caso de que aparecieran precipitados de orceína, se debe filtrarla antes de realizar mas preparaciones.

c) Seleccionar si el preparado posee el material de nuestro interés (células meióticas o mitóticas). En caso contrario desecharlo.

d) Comprobar que el aplastado fue el adecuado de forma que las células de nuestro interés quedaron en un solo plano, En caso de que las células siguen en varios planos se vuelve a aplastar hasta conseguirlas en uno solo.

Una vez obtenidas estas condiciones, se quita cuidadosamente el exceso de colorante tanto del porta como el cubreobjeto. Luego se realiza el sellado del cubreobjetos aplicando dos manos de barniz de uñas transparente sobre los bordes del cubreobjetos. Una vez seco, esta preparación se puede observar al microscopio utilizando objetivos de inmersión. Estas preparaciones son transitorias por lo que se recomienda realizar su análisis lo mas pronto posible. Ellas se conservan mas tiempo guardándolas en el refrigerador.

Con esta preparación se puede realizar la descripción detallada de la meiosis y del cariotipo mitótico (gonial) de cada especie. Para el estudio de la meiosis se utilizan varios caracteres cromosómicos útiles para diferenciar las especies de triatominos que son: número cromosómico, mecanismo sexual, tamaño comparativo de los autosomas y de los cromosomas sexuales, comportamiento durante la meiosis (por ejemplo si existe asociación o no de los sexuales con los autosomas), etc (Pérez et al. 1992, Panzera et al. 1995).

B. Técnica de Bandeo C

Para poder detectar las regiones de heterocromatina constitutiva se aplica la técnica de bandeo C (Sumner 1972), dichas regiones en general corresponden a DNA altamente repetido. Este marcador permite caracterizar cada especie por el número de bandas, localización y cantidad de heterocromatina C. Mediante este marcador es posible diferenciar especies (Panzera et al. 1997), determinar relaciones evolutivas (Panzera et al. 1995) e incluso detectar variabilidad poblacional (Panzera et al. 1992).

El estudio de los patrones de bandeo C en cada cromosoma se realiza en prometafase mitótica debido al menor grado de condensación cromosómica que existe en esta fase y que permite visualizer mas detalles estructurales que los que se observan en metafase mitótica. También se pueden observar en metafase I y II de la meiosis.

C.- Obtención de las preparaciones para bandas C por el método de aplastado.-

Para realizar la técnica de bandeo C se requiere preparar el material de la siguiente manera: el material previamente fijado en 3:1 se coloca sobre un vidrio de reloj, en el que hay una solución de ácido acético al 50%. Primero, bajo el microscopio, se limpia de tráqueas y se seleccionan los túbulos de las gónadas. Luego sobre el portaobjetos se disgregan con unas pinzas. En caso necesario se le agrega otra gota de ácido acético al portaobjetos con el objeto de que el material no se seque. Se coloca un cubreobjeto y se realiza la dispersión con el lápiz y el posterior aplastado con el pulgar.

Se observa al microscopio con un objetivo 2OX o 4OX en contraste de fases para comprobar si el preparado posee el material adecuado para nuestros análisis y si las células se encuentran en un solo plano. Si no hay material se desecha el preparado y si hubiera se vuelve a aplastar y se sumerge el preparado en nitrógeno líquido o hielo seco para poder levantar el cubreobjetos. Se toma al portaobjetos con unas pinzas de la parte esmerilada, se calienta un poco el cubreobjetos pasándole por encima un dedo y con un bisturí se despega el cubreobjetos a partir de una orilla tratando de no arrastrar el material. Se pone a escurrir el portaobjetos y se deja secar. Si se deja para el siguiente día es mejor taparlo para evitar el polvo del ambiente. Al día siguiente se realiza la técnica de bandeo C según lo descrito en Panzera et al. (1992), con tinción con Giemsa.